Polski

Płyn Ustny-OF Oral Fluid

Płyn ustny OF (Oral Fluid) jako materiał do badań laboratoryjnych

Stale postępująca konsolidacja produkcji trzody chlewnej oraz dążenie do zapewnienia zwierzętom odpowiednich warunków ich utrzymania-zgodnych z wytycznymi dobrostanu zwierząt-prowadzą również do konieczności opracowywania nowych technik pobierania materiału do badań laboratoryjnych.Łatwość pobrania,czas,bezpieczeństwo czy minimalizacja stresu u zwierząt poddawanych próbobraniu są jednymi z głównych czynników ograniczających różne techniki próbobrania.Jedną, ze stosunkowo nowych technik pobierania materiału do badań laboratoryjnych, jest pobieranie płynu ustnego od świń.

Medycyna ludzka wykorzystuje badanie płynu ustnego już ponad 20 lat.W medycynie ludzkiej płyn ustny służy do wykrywania zarówno antygenów jak i przeciwciał potwierdzających zkażenie np.HIV czy wirusem ospy,stosowany jest również do detekcji leków,narkotyków,sterydów anabolicznych czy ostatnimi czasy do określania występowania specyficznych znaczników różnych nowotworów. W medycynie weterynaryjnej płyn ustny jest wykorzystywany od 2005 roku i służy,jak na razie,do wykrywania:

  • -PRRSV-test ELISA(czułość do 94% i specyficznośc na poziomie 100%),PCR oraz RT-PCR
  • -PCV2-test PCR
  • -SIV-test ELISA i PCR
  • -Mycoplasma hyopneumoniae-test PCR
  • -Haemophilus parasuis-test PCR
  • -Mycoplasma hyorhinis-test PCR

Opracowywanie testów wykrywających Salmonella spp,Erysipelothrix rhusiopathiae czy Actinobacillus pleuropneumoniae prawdopodobnie rozszerzy w niedługim czasie możliwośći diagnostyczne z użyciem płynu ustnego.

W przyszłości płyn ustny może być wykorzystywany do innych celów np.wykrywania antybiotyków u świń przeznaczonych do sprzedaży na rzeź.Obecnie do tego celu pobierane są: mocz, surowica lub tkanki.

Czym jest płyn ustny?

Płyn ustny OF jest mieszaniną śliny oraz przesięku błony śluzowej jamy gębowej.Ślina jest wydzieliną gruczołów śliniankowych,natomiast przesięk powstaje głównie w wyniku przechodzenia płynu z drobnych naczyć,poprzez błonę śluzową policzków do światła jamy gębowej.Płyn ustny może zawierać, zarówno przeciwciała jak i same antygeny poszczególnych patogenów. Procedura pobierania płynu ustnego od świń

1.Bawełnianą linę zawieszamy na wysokości dostosowanej do wielkości świń tj. koniec liny powinien znajdować się plus/minus na wysokości łopatki-ramienia świń.Lina musi być łatwo dostępna ale nie powinna dotykać podłoża.Liny nie powinno umieszczać się blisko źródła wody i/lub karmników,co ogranicza niepotrzebne zanieczyszczenie pobieranego materiału.

Pamiętaj!

Lina bawełniana ma najlepsze właściwośći absorbcyjne płynów.W serii wielu testów,z użyciem różnych linek (wełnianych,syntetycznych itp) bawełna okazała się bezkonkurencyjna.

Dla poszczególnych grup wiekowych świń ustalono ,że najbardziej odpowiednia grubość liny dla warchlaków to lina o śrdnicy około 1,3cm natomiast dla starszych świń 1,6cm.Dobry efekt (ilość materiału-płynu) uzyskujemy również poprzez stosowanie liny plątanej z kilku linek bawełnianych (2-3 splotów dających w sumie żądaną średnicę liny) w zamian za stosowanie jednolitej grubej liny.

2.Linę mocujemy na specjalnych wieszakach lub ,tak jak robi się to w praktyce terenowej,przywiązujemy ją do dostępnych elementów przegrody kojca.Wykorzystując naturalną ciekawość świń,lina praktycznie natychmiast jest gryziona i rzuta.Pozostawienie liny na około 20-30 minut jest wystarczające do pobrania wystarczającej ilości płynu ustnego do dalszych badań.

Pamiętaj!

Lina musi być bardzo mocno przywiązana do przegrody,wielokrotnie zdaża się,że linę znajuduje się w kojcu lub znalezienie jej jest wręcz niemożliwe.

Na czas, potrzebny do pobrania płynu ustnego, ma wpływ aktywność świń,która może być uzależniona od:

temperatury otoczenia

a)zbyt wysoka temperatura otoczenia- prowadzi do powstawania ospałości u zwierząt i generalnego zmniejszenia aktywności ruchowej b)zbyt niska temperatura otoczenia- stosunkowo łatwo rozpoznawalna w chlewni poprzez obserwację zjawiska zbijania się świń w grupy lub tzw. stosy,również może negatywnie wpływać na ilośc pobranego płynu ustnego poprzez zmniejszenie się aktywności ruchowej świń w odpowiedzi na zbyt niską temperaturę otoczenia.

rodzaj podłożageneralnie można przyjąć,że świnie przebywające na rusztach plastikowych/ betonowych są bardziej chętne do rzucia zawieszonej liny.Zawieszona lina w „jałowym’ środowisku kojca plastikowego lub betonowego jest dla świń niemałą rozrywką.Podłoże ściołowe powoduje ,że świnie mają stały dostęp do ściółki (słomy),ich naturalny instynkt rycia i rzucia jest w dużej mierze zaspokojony i nie są tak chętne do interesowania się czymś innym tj. zawieszoną liną.

zdrowotności świńwybuch choroby,prowadzi zwykle do znacznego zmniejszenia się ilości pobieranego płynu ustnego.Chore zwierzęta niechętnie wstają,nie spożywają paszy i piją mniejsze ilości wody.

wiek świńmożna w uproszczeniu przyjąć,że od starszych świń jesteśmy w stanie uzyskać więcej materiału niż od świń młodszych.

pora dniaświnie są zwykle dużo bardziej aktywne do południa

Pamiętaj!

Odsadzenie świń ma również negatywny wpływ na ilość pozyskiwanwgo materiału do badań,co związane jest ze stresem poodsadzeniowym. Mając wszystkie powyższe czynniki na uwadze,w warunkach praktycznych,w celu optymalizacji ilośći pobieranego płynu ustnego,należy wydłużyć czas zawieszenia liny w kojcu do np. 60 czy 90 minut lub zwiększyć ilość zawieszanych linek.

3. Po określonym czasie rzucia liny przez zwierzęta, linę należy wycisnąć.Do wyciskania płynu z liny używane są specjalne wałki gdzie lina przechodzi przez nie jak przez magiel lub co jest dużo łatwiejsze i tańsze na nadal umocowaną linę nakładamy worek ściskamy mocno dłońmi jego wlot i ruchem w dół (od miejsca umocowania w kierunku końca) wyciskamy płyn z liny do worka.

4. Wyciśnięty do worka płyn jest przeważnie mocno zanieszczyszczony i przypomina wyglądem brudną wodę.W celu wstępnego oczyszczenia pobranego materiału,płyn możemy poddać wirowaniu,ale nie jest to konieczne.Płyn z worka przelewamy poprzez odcięcie jednego rogu worka,do probówki lub probówek.Płyn z worka można również pobrać pipetą i rozlać do probówek.Do celów diagnostycznych potrzebujemy minimum 4ml płynu.

5.Ze względu na znaczne wspomniane wczesniej zanieczyszczenie pobranego płynu ustnego,pobrany materiał powinien być jak najszybciej schłodzony i dostarczony do laboratorium zachowując standardowe procedury transportu próbek tj.zabezpieczenie przed wyciekaniem oraz obłożenie próbek wkładami schładzającymi.

Gdzie i ile lin wieszać?

W zależności od potrzeb tj.tego jakiej odpwiedzi oczekujemy ,liny możemy wiązać: -jednorazowo w celu potwierdzenia lub wykluczenia występowania określonych patogenów w danym stadzie -planowo np. co 2 tygodnie w celu określenia dynamiki określonego patogenu występującego w stadzie.Planowe wieszanie lin zakłada pobieranie płynu ustnego co 2 tygodnie zawsze z tych samych kojców.

Pamiętaj!

W celu optymalizacji detekcji/wykluczenia występowania danego patogenu w stadzie, liny należy wiązać w kilku kojcach danego budynku,umiejscowionych w różnych jego miejscach.Próby płynu ustnego nie powinny być łączone ze sobą-pulowane.

Biorąc pod uwagę fakt ,że nie wszystkie świnie będą rzuły linę (zwykle 75%) oraz to,że nie wiemy na jakim poziomie dany patogen krąży w danym stadzie,można przyjąć,że jedna lina powinna przypadać na około 100-150 świń.W porównaniu do ilości pobieranych zwykle prób surowicy tj.7-10,można uznać ,że jedna lina jest wystarczająca do rutynowej kontroli statusu zdrowotnego danej fermy.Ilość lin należy zwiększyć w momencie podejrzewania,że dany patogen występuje w stadzie na bardzo niskim poziomie tj. niewielka ilość świń będzie odpowiadać w testach wynikiem pozytywnym.

Interpretacja wyników

Podobnie jak w przypadku surowicy krwi pozytywny wynik w tescie PCR świadczy o aktywnym krążeniu patogenu w obrębie stada,natomiast pozytywny wynik w tescie ELISA Ab (wykrywającym przeciwciała) świadczy o tym,że proces chorobowy trwa już jakiś czas minimum kilka do kilkanastu dni.

Ciekawostka

Udowodniono,że zgodność detekcji PRRS w testach PCR płynu ustnego oraz surowicy krwi wynosiła 100% począwszy od dnia 7 od infekcji. W późniejszym terminie dowiedziono,że wykrywalnośc antygenu PRRSV w teście PCR jest znacznie wyższa dla płynu ustnego -90% po 21 dniach od infekcji niż surowicy gdzie uzyskano tylko 80% pozytywnych wyników na 21 dni po zakażeniu wirusem PRRS.

Z ostatnich prac pochodzących z ISU (Iowa State University) wynika,że obecnie używane przez ten uniwersytet testy ELISA są w stanie wykryć przeciwciała skierowane przeciwko PRRSV juz od 9 dnia po infekcji w porównaniu do średnio 14-17 dni potrzebych do ich detekcji używając surowicy krwi jak źródła przeciwciał.

Plusy i minusy stosowania płynu ustnego-OF

Zalety OF

-pobieranie materiału jest całkowicie nie inwazyjne -w trakcie pobierania nie potrzebujemy igieł czy pętli ryjowych do unieruchomienia świń -stosowanie tej techniki prowadzi do ograniczenia stresu u zwierząt do minimum -nie bez znaczenia jest również znacznie podwyższone bezpieczeństwo dla ludzi pobierających materiał do badań -łatowść pozyskania materiału -technika wymaga właściwie minimum doświadczenia -suma kosztów pobrania oraz samego badania OF są znacznie niższe niż koszty pobierania i badania surowicy krwi -pobranie materiału wymaga mało czasu tj około 30 minut -potrzebne do pobierania rzeczy są tanie i ogólnie dostępne -technika jest zgodna z zasadami dobrostanu zwierząt

Wady OF

-nie od wszystkich grup wiekowych świń,pobieranie OF jest łatwe i/lub nawet niemożliwe-głównym problemem pozostaje pobieranie prób od prosiąt ssących.W celu zachęcania prosiąt do rzucia linki ,linkę możemy lekko namoczyć w roztworze np.cukru -ze względu na technikę pobierania materiału,czynniki takie jak kurz,odchody czy enzymy zawarte w ślinie mogą wpływać negatywnie na wynik testu -płyn ustny doskonale nadaje się do detekcji antygenu i/lub przeciwciał ale nie nadaje się do izolacji patogenu w celu np. dalszej hodowli.

–patogeny obecne w środowisku np. PCV2 czy parwowirus również będą ewentualnie wykryte dlatego też:

-stosuj standardowe procedury mycia i dezynfekcji chlewni w celu eliminacji wyników trudnych do zinterpretowania

–stosowanie do paszy plazmy krwi może wpływać na pojawianie się wyników fałszywie dodatnich.Plazma krwi stosowana jako dodatek głównie dla macior i prosiąt do 14 dni po odsadzeniu ,może zawierać swoiste przeciwciała,które mogą być ewentualnie wykryte w tescie OF.Usunięcie plazmy krwi z paszy eliminuje to zjawisko w bardzo krótkim czasie.

Dostępne w literaturze światowej informacje,świadczące o wysokiej „użytecznośc” płynu ustnego w weterynaryjnych badaniach laboratoryjnych świń,nie pozwalają na pominięcie tej techniki jako rutynowej metody próbobrania w obrębie stad trzody chlewnej.Prostota pobierania materiału,wysoka czułośći i specyficzność dostępnych testów czy ograniczenie do minimum stresu związanego z koniecznością pobierania prób u zwierząt są jednymi z głównych zalet pobierania płynu ustnego.W Polsce,komercyjne badanie płynu ustnego jest już możliwe, co daje możliwość korzystania z tej wysoce skutecznej techniki również w naszym kraju.